IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) është një analog i substratit β-galaktozidazë, i cili është shumë i induktueshëm. Nën induksionin e IPTG, induktori mund të formojë një kompleks me proteinën represore, në mënyrë që konformacioni i proteinës represore të ndryshojë, në mënyrë që ajo të mos mund të kombinohet me gjenin e synuar, dhe gjeni i synuar të shprehet në mënyrë efikase. Pra, si duhet të përcaktohet përqendrimi i IPTG gjatë eksperimentit? A është sa më i madh aq më mirë?
Së pari, le të kuptojmë parimin e induksionit IPTG: Operoni (elementi) i laktozës së E. coli përmban tre gjene strukturore, Z, Y dhe A, të cilat kodojnë përkatësisht β-galaktozidazën, permeazën dhe acetiltransferazën. lacZ hidrolizon laktozën në glukozë dhe galaktozë, ose në alo-laktozë; lacY lejon që laktoza në mjedis të kalojë nëpër membranën qelizore dhe të hyjë në qelizë; lacA transferon grupin acetil nga acetil-CoA në β-galaktozid, gjë që përfshin heqjen e efektit toksik. Përveç kësaj, ekziston një sekuencë operative O, një sekuencë fillestare P dhe një gjen rregullator I. Kodi i gjenit I është një proteinë represore që mund të lidhet me pozicionin O të sekuencës operatore, në mënyrë që operoni (meta) të shtypet dhe të fiket. Ekziston gjithashtu një vend lidhës për vendin e lidhjes së proteinës aktivuese të gjenit katabolik-CAP në rrjedhën e sipërme të sekuencës fillestare P. Sekuenca P, sekuenca O dhe vendi i lidhjes CAP së bashku përbëjnë rajonin rregullator të operonit lac. Gjenet koduese të tre enzimave rregullohen nga i njëjti rajon rregullator për të arritur shprehjen e koordinuar të produkteve të gjeneve.
Në mungesë të laktozës, operoni lac (meta) është në gjendje represioni. Në këtë kohë, represori lac i shprehur nga sekuenca I nën kontrollin e sekuencës promotore PI lidhet me sekuencën O, e cila parandalon lidhjen e ARN polimerazës me sekuencën P dhe pengon fillimin e transkriptimit; kur laktoza është e pranishme, operoni lac (meta) mund të induktohet. Në këtë sistem operoni (meta), induktori i vërtetë nuk është vetë laktoza. Laktoza hyn në qelizë dhe katalizohet nga β-galaktozidaza për t'u shndërruar në alolaktozë. Kjo e fundit, si një molekulë induktori, lidhet me proteinën represore dhe ndryshon konformacionin e proteinës, gjë që çon në shkëputjen e proteinës represore nga sekuenca O dhe transkriptimi. Izopropiltiogalaktozidi (IPTG) ka të njëjtin efekt si alolaktoza. Është një induktor shumë i fuqishëm, i cili nuk metabolizohet nga bakteret dhe është shumë i qëndrueshëm, kështu që përdoret gjerësisht në laboratorë.
Si të përcaktohet përqendrimi optimal i IPTG? Merrni si shembull E. coli.
Lloji i E. coli BL21 i modifikuar gjenetikisht që përmbante pGEX rekombinant pozitiv (CGRP/msCT) u inokulua në një mjedis të lëngshëm LB që përmbante 50μg·mL-1 Amp dhe u kultivua gjatë natës në 37°C. Kultura e mësipërme u inokulua në 10 shishe me 50mL mjedis të lëngshëm LB të freskët që përmbante 50μg·mL-1 Amp në një raport prej 1:100 për kulturë zgjerimi dhe kur vlera OD600 ishte 0.6~0.8, IPTG iu shtua përqendrimit përfundimtar. Është 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Pas induksionit në të njëjtën temperaturë dhe në të njëjtën kohë, prej tij u mor 1 mL e tretësirës bakteriale, dhe qelizat bakteriale u mblodhën me anë të centrifugimit dhe iu nënshtruan SDS-PAGE për të analizuar ndikimin e përqendrimeve të ndryshme të IPTG në shprehjen e proteinave, dhe më pas u zgjodh përqendrimi i IPTG me shprehjen më të madhe të proteinave.
Pas eksperimenteve, do të zbulohet se përqendrimi i IPTG nuk është aq i madh sa të jetë e mundur. Kjo për shkak se IPTG ka një toksicitet të caktuar ndaj baktereve. Tejkalimi i përqendrimit do të vrasë edhe qelizën; dhe në përgjithësi, shpresojmë që sa më shumë proteinë e tretshme të shprehet në qelizë, aq më mirë, por në shumë raste kur përqendrimi i IPTG është shumë i lartë, do të formohet një sasi e madhe e përfshirjes. Trupi, por sasia e proteinës së tretshme zvogëlohet. Prandaj, përqendrimi më i përshtatshëm i IPTG shpesh nuk është sa më i madh aq më mirë, por sa më i ulët përqendrimi.
Qëllimi i induksionit dhe kultivimit të llojeve të modifikuara gjenetikisht është rritja e rendimentit të proteinës së synuar dhe ulja e kostove. Shprehja e gjenit të synuar nuk ndikohet vetëm nga faktorët e vetë llojit dhe plazmidi i shprehjes, por edhe nga kushte të tjera të jashtme, siç janë përqendrimi i induktorit, temperatura e induksionit dhe koha e induksionit. Prandaj, në përgjithësi, përpara se një proteinë e panjohur të shprehet dhe pastrohet, është mirë të studiohet koha e induksionit, temperatura dhe përqendrimi i IPTG në mënyrë që të zgjidhen kushtet e përshtatshme dhe të merren rezultatet më të mira eksperimentale.
Koha e postimit: 31 dhjetor 2021