Ditiotreitoli (DTT) është një agjent reduktues i përdorur zakonisht, i njohur edhe si aditiv i ri i gjelbër. Është një përbërës organik me molekulë të vogël me dy grupe merkaptanësh (-SH). Për shkak të vetive reduktuese dhe stabilitetit të tij, DTT përdoret gjerësisht në eksperimentet e biokimisë dhe biologjisë molekulare.
Roli kryesor i DTT është të zvogëlojë lidhjet disulfide në proteina dhe biomolekula të tjera. Lidhja disulfide është një pjesë e rëndësishme e palosjes dhe stabilitetit të proteinave, por në kushte të caktuara eksperimentale, siç është analiza SDS-PAGE e reduktueshme, rekombinimi dhe palosja e proteinave, është e nevojshme të reduktohet lidhja disulfide në dy grupe tiol për të zbuluar strukturën hapësinore të proteinës. DTT mund të reagojë me lidhjet disulfide për t'i reduktuar ato në grupe merkaptan, duke hapur kështu strukturën hapësinore të proteinës dhe duke e bërë të lehtë për t'u analizuar dhe manipuluar.
DTT mund të përdoret gjithashtu për të mbrojtur aktivitetin dhe stabilitetin e enzimës. Në disa reaksione të katalizuara nga enzimat, aktiviteti i enzimës mund të reduktohet nga oksiduesi. DTT mund të reagojë me oksiduesit për t'i reduktuar ato në substanca të padëmshme, duke mbrojtur kështu aktivitetin dhe stabilitetin e enzimës.
Krahasuar me agjentët reduktues tradicionalë si β-merkaptoetanoli (β-ME), DTT konsiderohet si një agjent reduktues më i sigurt dhe më i qëndrueshëm. Ai jo vetëm që është i qëndrueshëm në tretësirë ujore, por ruan edhe vetitë e tij reduktuese në temperatura të larta dhe kushte acido-bazike.
Përdorimi i DTT është relativisht i thjeshtë. Në përgjithësi, DTT tretet në një tampon të përshtatshëm dhe më pas shtohet në sistemin eksperimental. Përqendrimi optimal i DTT duhet të përcaktohet sipas eksperimentit specifik dhe përdoret përgjithësisht në rangun 0.1-1mM. Përqendrimet më të ulëta mund të zvogëlojnë efektet negative në rritjen e qelizave dhe mund të zvogëlojnë citotoksicitetin për shkak të mbishprehjes së proteinave të synuara. Përqendrimet më të larta mund të shkaktojnë ngarkesë të tepërt metabolike qelizore, duke ndikuar në rritjen e qelizave dhe efikasitetin e shprehjes.
Mënyra për të përcaktuar përqendrimin optimal mund të jetë vlerësimi i nivelit të shprehjes së proteinës së synuar duke kryer teste induksioni IPTG në përqendrime të ndryshme. Testet e kulturës në shkallë të vogël mund të kryhen duke përdorur një gamë përqendrimesh IPTG (p.sh. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, etj.) dhe efekti i shprehjes në përqendrime të ndryshme mund të vlerësohet duke zbuluar nivelin e shprehjes së proteinës së synuar (p.sh. zbulimi Western blot ose fluoreshenca). Sipas rezultateve eksperimentale, përqendrimi me efektin më të mirë të shprehjes u zgjodh si përqendrimi optimal.
Përveç kësaj, mund t'i referoheni edhe literaturës përkatëse ose përvojës së laboratorëve të tjerë për të kuptuar diapazonin e përqendrimit të IPTG-së të përdorur zakonisht në kushte të ngjashme eksperimentale, dhe më pas të optimizoni dhe përshtatni sipas nevojave eksperimentale.
Është e rëndësishme të theksohet se përqendrimi optimal mund të ndryshojë në varësi të sistemeve të ndryshme të shprehjes, proteinave të synuara dhe kushteve eksperimentale, kështu që është më mirë të optimizohet rast pas rasti.
Si përmbledhje, DTT është një agjent reduktues i përdorur zakonisht që mund të përdoret për të zvogëluar lidhjet disulfide në proteina dhe biomolekula të tjera dhe për të mbrojtur aktivitetin dhe stabilitetin enzimatik. Është përdorur gjerësisht në eksperimentet e biokimisë dhe biologjisë molekulare.
Koha e postimit: 28 shtator 2023