Dithiothreitol (DTT) është një agjent reduktues i përdorur zakonisht, i njohur gjithashtu si aditiv i ri i gjelbër.Është një përbërje organike e vogël molekulare me dy grupe mercaptan (-SH).Për shkak të vetive reduktuese dhe stabilitetit, DTT përdoret gjerësisht në eksperimentet e biokimisë dhe biologjisë molekulare.
Roli kryesor i DTT është të reduktojë lidhjet disulfide në proteina dhe biomolekula të tjera.Lidhja disulfide është një pjesë e rëndësishme e palosjes dhe stabilitetit të proteinave, por në kushte të caktuara eksperimentale, si analiza e reduktueshme SDS-PAGE, rikombinimi dhe palosja e proteinave, është e nevojshme të reduktohet lidhja disulfide në dy grupe tiol për të zbërthyer strukturën hapësinore të proteina.DTT mund të reagojë me lidhjet disulfide për t'i reduktuar ato në grupe mercaptan, duke hapur kështu strukturën hapësinore të proteinës dhe duke e bërë të lehtë për t'u analizuar dhe manipuluar.
DTT mund të përdoret gjithashtu për të mbrojtur aktivitetin dhe stabilitetin e enzimës.Në disa reaksione të katalizuara nga enzima, aktiviteti i enzimës mund të reduktohet nga oksiduesi.DTT mund të reagojë me oksidantë për t'i reduktuar në substanca të padëmshme, duke mbrojtur kështu aktivitetin dhe stabilitetin e enzimës.
Krahasuar me agjentët reduktues tradicionalë si β-merkaptoetanoli (β-ME), DTT konsiderohet të jetë një agjent reduktues më i sigurt dhe më i qëndrueshëm.Ai nuk është vetëm i qëndrueshëm në tretësirë ujore, por gjithashtu ruan vetitë e tij reduktuese në kushte të temperaturës së lartë dhe acid-bazë.
Përdorimi i DTT është relativisht i thjeshtë.Në përgjithësi, DTT shpërndahet në një tampon të përshtatshëm dhe më pas shtohet në sistemin eksperimental.Përqendrimi optimal i DTT duhet të përcaktohet sipas eksperimentit specifik dhe përgjithësisht përdoret në intervalin 0.1-1 mM.Përqendrimet më të ulëta mund të zvogëlojnë efektet negative në rritjen e qelizave dhe mund të reduktojnë citotoksicitetin për shkak të mbishprehjes së proteinave të synuara.Përqendrimet më të larta mund të shkaktojnë ngarkesë të tepërt metabolike të qelizave, duke ndikuar në rritjen e qelizave dhe efikasitetin e shprehjes.
Mënyra për të përcaktuar përqendrimin optimal mund të jetë vlerësimi i nivelit të shprehjes së proteinës së synuar duke kryer teste induksioni IPTG në përqendrime të ndryshme.Testet e kulturës në shkallë të vogël mund të kryhen duke përdorur një sërë përqendrimesh IPTG (p.sh. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, etj.) dhe efekti i shprehjes në përqendrime të ndryshme mund të vlerësohet duke zbuluar nivelin e shprehjes së proteinës së synuar (p.sh. Western zbulimi i blotit ose fluoreshencës).Sipas rezultateve eksperimentale, si përqendrimi optimal u zgjodh përqendrimi me efektin më të mirë të shprehjes.
Përveç kësaj, mund t'i referoheni edhe literaturës përkatëse ose përvojës së laboratorëve të tjerë për të kuptuar diapazonin e përqendrimit të IPTG të përdorur zakonisht në kushte të ngjashme eksperimentale, dhe më pas të optimizoni dhe rregulloni sipas nevojave eksperimentale.
Është e rëndësishme të theksohet se përqendrimi optimal mund të ndryshojë në varësi të sistemeve të ndryshme të shprehjes, proteinave të synuara dhe kushteve eksperimentale, kështu që është më mirë të optimizohet rast pas rasti.
Në përmbledhje, DTT është një agjent reduktues i përdorur zakonisht që mund të përdoret për të reduktuar lidhjet disulfide në proteina dhe biomolekula të tjera dhe për të mbrojtur aktivitetin dhe stabilitetin e enzimës.Është përdorur gjerësisht në eksperimentet e biokimisë dhe biologjisë molekulare.
Koha e postimit: Shtator-28-2023